# Apéndice A: Protocolo del Cubo de Agua (WBP) #### El Protocolo del Cubo de Agua (WBP) Nuestro equipo confiesa un secreto deleite por un nombre tan simple para un problema tan complejo como la estandarización del análisis de eDNA de ciencia de frontera en sitios de campo remotos operados por jóvenes indígenas. La fuente de la idea es verdaderamente bicultural y multidisciplinaria, como se describe en [Apéndice B](/methodology/es/apendices/apendice-b-diseno-bicultural-y-coautoria.md). NOTA: Este protocolo está en desarrollo activo; lo que está escrito en esta página cambiará y se actualizará en el próximo año en respuesta a la retroalimentación continua de los evaluadores piloto (véase Bricolaje) #### **Propósito del WBC** **El protocolo del cubo de agua estandariza la recolección de datos de eDNA.** Al usar agua filtrada, un período de tiempo estandarizado y centroides de parcelas, reduce el ruido y mejora la señal en la recolección de datos de eDNA. Para recapitular la [Cálculo de la biodiversidad](/methodology/es/biodiversidad/calculo-de-biodiversidad.md) sección, esto ofrece un enfoque coherente para comparar sitios a lo largo del tiempo y evaluar cambios en la integridad del ecosistema. **El objetivo es reducir costos y mejorar la precisión al usar eDNA como métrica**. Los resultados deberán normalizarse estadísticamente a una curva estandarizada por proyecto para el aumento de la integridad a lo largo del tiempo. El WBC simplemente facilita eso al reducir los datos disponibles a un conjunto más significativo, reduciendo el tamaño de muestra necesario para cumplir los requisitos de producción de las Unidades Interoperables de Biodiversidad (IBU) y calificar para ingresos recurrentes por créditos de biodiversidad por aumento (aproximadamente 300 $/unidad, véase [Unidad de biodiversidad](/methodology/es/biodiversidad/unidad-de-biodiversidad.md)). #### Limitaciones del WBC Existen serias limitaciones prácticas para las pruebas de eDNA en el campo. La ausencia de niveles de referencia establecidos de eDNA en los distintos ecosistemas sigue siendo el principal desafío para utilizar eDNA en evaluaciones de aumento de la biodiversidad mediante IBU, agravado por las dificultades logísticas de exportar muestras y los costos del análisis para obtener métricas de eDNA. Un posible enfoque es establecer un muestreo de referencia de eDNA en bosques intactos o antiguos, que representan la conservación en la Fig. 4C. Las métricas tradicionales simples de biodiversidad, como la riqueza de especies, son muy adecuadas para el monitoreo basado en la comunidad, pero tienen bajo poder estadístico y, por lo tanto, requieren un esfuerzo de muestreo considerable para detectar de manera fiable los cambios ecológicos [(Lamb et al. 2009)](https://doi.org/10.1016/j.ecolind.2008.06.001). El error aleatorio en las muestras de eDNA también puede ser alto y afectar la integridad de los datos [(Lahoz-Monfort et al. 2016)](https://doi.org/10.1111/1755-0998.12486). Por lo tanto, el monitoreo rentable requiere un muestreo estadísticamente robusto, idealmente con curvas normalizadas regionales, aunque estas pueden ser más costosas de desarrollar en zonas con mayor biodiversidad. Dicho esto, creemos en avanzar los límites donde los encontramos, de la forma más práctica posible. El protocolo a continuación tiene la intención de reducir el ruido del muestreo de manera rentable. #### **Lugar de muestreo** Aunque nuestros cálculos de IBU están diseñados para áreas de una hectárea, el muestreo se realiza en el centroide de una parcela (promediando cinco hectáreas) para optimizar las condiciones del propio sistema agroforestal en lugar de la biodiversidad que tiende a acumularse en los bordes de las áreas cultivadas. El tamaño de la parcela debe usarse como covariable en el modelado estadístico posterior (véase[ Cálculos de biodiversidad](/methodology/es/biodiversidad/calculo-de-biodiversidad.md)). #### **Materiales** * Cuatro cubos obtenidos localmente, esterilizados * Solución de lejía al 10% (para esterilización); agua limpia (para enjuague) * \~4 L de agua filtrada para el llenado * Una botella de muestra de 1 L esterilizada y enjuagada dos veces * Guantes y mascarillas * Kit de filtración SimplexDNA ([simplexdna.com](https://www.simplexdna.com/)) * KoboToolbox o equivalente para la captura de datos en campo La coloración de los cubos debe seguir un esquema coherente: colores claros para atraer polinizadores, colores oscuros o terrosos para atraer insectos que habitan en la madera. El material, la forma y el color del cubo pueden variar entre experimentos, pero deben mantenerse constantes dentro de un mismo esfuerzo de muestreo y ajustarse a los objetivos de la recolección de datos. #### **Procedimiento** 1. **Esterilizar.** Limpie cada cubo con una solución de lejía al 10% y enjuáguelo dos veces con agua. Para evitar la contaminación cruzada, esterilice en el lugar, en el campo, o selle los cubos durante el transporte desde el sitio de desinfección. 2. **Colocar.** Coloque los cuatro cubos alrededor del centroide de la parcela, aproximadamente a 10 m de distancia entre sí. Estabilícelos para que no puedan volcarse: apóyelos con palos en terrenos inclinados; póngales peso con piedras donde haya animales de pastoreo. Mantenga una colocación coherente entre campos (siempre en campo abierto, o siempre cerca de arbustos): la comparabilidad entre sitios importa más que cualquier elección individual de colocación. 3. **Llenar.** Añada aproximadamente 1 L de agua filtrada a cada cubo. Coloque en el agua un palo tomado del área circundante para que los insectos que caigan dentro puedan salir; queremos su eDNA, no los insectos mismos. 4. **Exponer durante 72 horas.** Dejar sin perturbaciones. 5. **Observar.** Regrese después de 72 horas y registre para cada cubo: si llovió durante el período de exposición, el nivel de llenado y la presencia de cualquier organismo vivo o muerto. Fotografíe cada cubo. 6. **Compuesto.** Con guantes y mascarilla, use la botella esterilizada de 1 L para medir un litro de cada cubo y combine los cuatro en uno de los cubos restantes en el sitio. 7. **Filtrar y almacenar.** Filtre la muestra compuesta utilizando el kit SimplexDNA. El kit funciona manualmente (accionado por jeringa), es intuitivo en el campo y almacena el filtro en un tampón que preserva el ADN a temperatura ambiente, una ventaja práctica significativa donde no hay refrigeración disponible. El volumen filtrable varía según la carga de residuos; el filtro se obstruye progresivamente y puede requerir una fuerza considerable hacia el final de la filtración. #### **Figura X. Protocolo del cubo de agua, cubos de colores** --- # Agent Instructions: Querying This Documentation If you need additional information that is not directly available in this page, you can query the documentation dynamically by asking a question. Perform an HTTP GET request on the current page URL with the `ask` query parameter: ``` GET https://sexytrees.savimbo.com/methodology/es/apendices/apendice-a-protocolo-del-cubo-de-agua-wbp.md?ask= ``` The question should be specific, self-contained, and written in natural language. 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