# Apêndice A: Protocolo do Balde de Água (WBP) #### Protocolo do Balde de Água (WBP) Nossa equipe confessa um prazer secreto em um nome tão simples para um problema tão complexo como padronizar a análise de eDNA da ciência de fronteira em locais remotos de campo operados por jovens Indígenas. A origem da ideia é realmente bicultural e multidisciplinar, como descrito em [Apêndice B](/methodology/pt-br/apendices/apendice-b-design-bicultural-e-coautoria.md). NOTA: Este protocolo está em desenvolvimento ativo; o que está escrito nesta página vai mudar e ser atualizado no próximo ano, a partir do feedback contínuo dos testadores piloto (veja Bricolage) #### **Objetivo do WBC** **O protocolo do balde de água padroniza a coleta de dados de eDNA.** Ao usar água filtrada, um período de tempo padronizado e centroides de parcelas, ele reduz o ruído e melhora o sinal na coleta de dados de eDNA. Para recapitular a [cálculo de biodiversidade](/methodology/pt-br/biodiversidade/calculo-de-biodiversidade.md) seção, isso oferece uma abordagem consistente para comparar locais ao longo do tempo e avaliar mudanças na integridade do ecossistema. **O objetivo é reduzir custos e melhorar a precisão ao usar eDNA como métrica**. Os resultados precisarão ser normalizados estatisticamente para uma curva padronizada do projeto para o aumento da integridade ao longo do tempo. O WBC simplesmente torna isso mais fácil ao reduzir os dados disponíveis para um conjunto mais significativo, reduzindo o tamanho da amostra necessário para atender aos requisitos de saída para Interoperable Biodiversity Units (IBU) e qualificar para receita recorrente de créditos de biodiversidade de aumento (aproximadamente $300/unidade, veja [Unidade de biodiversidade](/methodology/pt-br/biodiversidade/unidade-de-biodiversidade.md)). #### Limitações do WBC Há restrições práticas sérias para testar eDNA em campo. A ausência de níveis de referência estabelecidos de eDNA entre ecossistemas continua sendo o principal desafio para usar eDNA em avaliações de aumento de biodiversidade via IBUs, agravado pelas dificuldades logísticas de exportar amostras e pelos custos da análise para obter métricas de eDNA. Uma possível abordagem é estabelecer uma linha de base de amostragem de eDNA em florestas intactas ou de crescimento antigo, representando conservação na Fig. 4C. Métricas simples e tradicionais de biodiversidade, como riqueza de espécies, são bem adequadas para monitoramento baseado na comunidade, mas têm baixo poder estatístico e, por isso, exigem um esforço de amostragem grande para detectar mudanças ecológicas de forma confiável [(Lamb et al. 2009)](https://doi.org/10.1016/j.ecolind.2008.06.001). O erro aleatório nas amostras de eDNA também pode ser alto e afetar a integridade dos dados [(Lahoz-Monfort et al. 2016)](https://doi.org/10.1111/1755-0998.12486). Portanto, um monitoramento com bom custo-benefício exige amostragem estatisticamente robusta, de preferência com curvas regionais normalizadas — embora elas possam ser mais caras de desenvolver em zonas mais biodiversas. Dito isso, acreditamos em avançar os limites onde os encontramos, da forma mais prática possível. O protocolo abaixo foi feito para reduzir o ruído da amostragem de forma custo-efetiva. #### **Local de amostragem** Embora nossos cálculos de IBU sejam feitos para áreas de um hectare, a amostragem é realizada no centroide de uma parcela (média de cinco hectares) para otimizar as condições do próprio sistema agroflorestal, e não a biodiversidade que tende a se acumular nas bordas das áreas cultivadas. O tamanho da parcela deve ser usado como covariável em modelagens estatísticas posteriores (veja[ Cálculos de biodiversidade](/methodology/pt-br/biodiversidade/calculo-de-biodiversidade.md)). #### **Materiais** * Quatro baldes de origem local, esterilizados * Solução de água sanitária a 10% (para esterilização); água limpa (para enxágue) * \~4 L de água filtrada para o preenchimento * Uma garrafa de amostra de 1 L esterilizada e enxaguada duas vezes * Luvas e máscaras faciais * Kit de filtração SimplexDNA ([simplexdna.com](https://www.simplexdna.com/)) * KoboToolbox ou equivalente para coleta de dados em campo A cor dos baldes deve seguir um esquema consistente: cores claras para atrair polinizadores, cores escuras ou da cor do terreno para atrair insetos que vivem em madeira. O material, o formato e a cor do balde podem variar entre experimentos, mas devem ser mantidos constantes dentro de um mesmo esforço de amostragem e alinhados aos objetivos da coleta de dados. #### **Procedimento** 1. **Esterilize.** Limpe cada balde com uma solução de água sanitária a 10% e enxágue duas vezes com água. Para evitar contaminação cruzada, esterilize no local, em campo, ou vede os baldes durante o transporte do local de desinfecção. 2. **Coloque.** Posicione os quatro baldes ao redor do centroide da parcela, com cerca de 10 m de distância entre eles. Estabilize para que não possam virar: apoie com gravetos em terreno inclinado; coloque pedras como peso onde houver animais de pasto. Mantenha o posicionamento consistente entre áreas (sempre em área aberta, ou sempre perto de arbustos) — a comparabilidade entre locais é mais importante do que qualquer escolha isolada de posição. 3. **Encha.** Adicione cerca de 1 L de água filtrada em cada balde. Coloque na água um graveto retirado da área ao redor para que quaisquer insetos que caiam dentro possam sair; queremos o eDNA deles, não os insetos em si. 4. **Exponha por 72 horas.** Não mexa. 5. **Observe.** Volte depois de 72 horas e registre, para cada balde: se choveu durante o período de exposição, o nível de enchimento e a presença de qualquer organismo vivo ou morto. Fotografe cada balde. 6. **Misture.** Usando luvas e máscara facial, use a garrafa esterilizada de 1 L para medir um litro de cada balde e combine os quatro em um dos baldes restantes no local. 7. **Filtre e armazene.** Filtre a amostra composta usando o kit SimplexDNA. O kit funciona manualmente (com seringa), é intuitivo em campo e armazena o filtro em um tampão que preserva o DNA em temperatura ambiente — uma vantagem prática importante onde não há refrigeração. O volume filtrável varia com a quantidade de detritos; o filtro entope aos poucos e pode exigir força considerável no final da filtração. #### **Figura X. Protocolo do balde de água, baldes coloridos** --- # Agent Instructions: Querying This Documentation If you need additional information that is not directly available in this page, you can query the documentation dynamically by asking a question. Perform an HTTP GET request on the current page URL with the `ask` query parameter: ``` GET https://sexytrees.savimbo.com/methodology/pt-br/apendices/apendice-a-protocolo-do-balde-de-agua-wbp.md?ask= ``` The question should be specific, self-contained, and written in natural language. The response will contain a direct answer to the question and relevant excerpts and sources from the documentation. Use this mechanism when the answer is not explicitly present in the current page, you need clarification or additional context, or you want to retrieve related documentation sections.